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免疫熒光技術(shù)操作步驟
更新時間:2011-06-01 點擊量:2197

 免疫熒光技術(shù)操作步驟 

 

.  直接免疫熒光法測抗原 

 

基本原理 

        將熒光素標記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少,相對使用標記抗體用量偏大。 

試劑與儀器 

          磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4 

          熒光標記的抗體溶液:以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 進行稀釋 

          緩沖甘油:分析純無熒光的甘油 + pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 份配制 

          搪瓷桶三只(內(nèi)有 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 1500ml) 

          有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊) 

          熒光顯微鏡 

          玻片架 

          濾紙 

          37℃溫箱等。 

實驗步驟 

1.  滴加 0.01mol/L,pH7.4 PBS于待檢標本片上,10min后棄去,使標本保持一定濕度。 

2.  滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,使其*覆蓋標本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),保溫一

30min  

定時間(參考:30min)。 

3.  取出玻片,置玻片架上,先用 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 沖洗后,再按順序過 0.01mol/L

pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不時振蕩。 

4.  取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。 

5.  立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度,一般可用“+”表示: 

-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++ 

--++++)熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上,而各種對照顯示為(±)

或(-),即可判定為陽性。

 

注意事項

1.  對熒光標記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋在 120-100 

間,要自行摸索*梯度,建立的稀釋比例,抗體濃度過低,會導致產(chǎn)生的熒光過弱,

影響結(jié)果的觀察。 

2.  染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化,染色時間可以從 10 min 到數(shù)

小時,一般 30 min 已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于 37℃可加強染色效果,

但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用 0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染

色過夜較 3730 min 效果好的多。 

3.  為了保證熒光染色的正確性,試驗時需設(shè)置下述對照,以排除某些非特異性熒光染

色的干擾。 

1)標本自發(fā)熒光對照:標本加 1-2 滴 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS。 

2)特異性對照(抑制試驗):標本加未標記的特異性抗體,再加熒光標記的特異性抗

體。 

    如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,  待檢標本呈強熒光,則為特異性陽性染色。 

4.  一般標本在高壓汞燈下照射超過 3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標本在當天觀察,隨著時間的延長,熒光強度會逐漸下降。

.    間接免疫熒光法測抗原 

 

基本原理 

染色程序分為兩步,*步,用已知未標記的抗體(待檢標本)加到已知抗原(待檢標本)

標本上,在濕盒中 37℃保溫 30min,使抗原抗體充分結(jié)合,然后洗滌,除去未結(jié)合的抗體。

第二步,加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗 IgG、IgM 抗體(通常為熒光標記的對應(yīng)二抗)。

如果*步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng),標記的熒光標記的二抗就會和已結(jié)合抗原的抗體進一步結(jié)

合,從而可鑒定被檢測抗原。 

試劑與儀器 

          磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4 

          緩沖甘油:分析純無熒光的甘油 + pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 份配制。

          熒光標記的抗人球蛋白抗體:以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 進行稀釋  。 

          搪瓷桶三只(內(nèi)有 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 1500ml) 

          有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊) 

          熒光顯微鏡 

          玻片架 

          濾紙 

          37℃溫箱等。 

實驗步驟 

1.  滴加 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 于未知抗原標本片,10min 后棄去,使標本片保持一定濕度。 

2.  滴加以 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 適當稀釋抗體,覆蓋未知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫 30min。 

3.  取出玻片,置于玻片架上,先用 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 沖洗 1-2 次,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 5min,不時振蕩  。 

4.  取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標記二

抗 

5.  將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫 30min。 

6.  重復(fù)操作 3。 

7.  取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。

8.  熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結(jié)果判定同直接法。 

注意事項 

1.  熒光染色后一般在 1h 內(nèi)完成觀察,或于 4℃保存 4h,時間過長  ,會使熒光減弱。 

2.  每次試驗時  ,需設(shè)置以下兩種對照: 

  

1) 陰性對照:陰性血清+熒光標記物   (需有使用人員自行建立標準) 

2) 熒光標記物對照:PBS+熒光標記物 

如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,  待檢標本呈強熒光,則為

特異性陽性染色。  

3.  未知抗原標本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。 

4.  所滴加的抗體或熒光標記物,應(yīng)始終保持在未知抗原標本片上,避免因放置不平使液體

流失,從而造成非特異性熒光染色。 

 

                  

Storage:  Store at –20 ºC for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The 

lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater 

than a year when kept at -20ºC. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent 

of antibody, the antibody is stable for at least six weeks at 2-4 ºC. 

 

Important Note:  This product as supplied is intended for research use only, not for use in 

human, therapeutic or diagnostic applications.     

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