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ELISA技術(shù)中的抗原抗體反應(yīng)
更新時間:2012-08-14 點擊量:2398

ELISA技術(shù)中的抗原抗體反應(yīng)

 

抗體的結(jié)構(gòu) 

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)。Ig分五類,即IgGIgA、IgM、IgDIgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為 IgGIgM。Ig由兩個輕鏈(L)和兩個重鏈(H)的單體組成。Ig的輕鏈是相同的,有κ(kappa)和λ(Lambda )兩種型別。五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同,這決定了它們的抗原性也不同。IgGIgM的重鏈分別稱為γ(gamma)鏈和μ(mu )鏈。 重鏈和輕鏈的 N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異,稱為可變區(qū),分別用VHVL表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位,只與相應(yīng)的抗原決定簇匹 配,發(fā)生特異性結(jié)合(見圖),是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段,其中兩個相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段(Fab)。每個Fab都保存結(jié)合抗原的能力,但只有一 個抗原結(jié)合位點,是單價的,與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段,無抗體活性,但具有IgG*的抗原性。 IgG可被胃蛋白酶分解為兩個片段,一個Fab雙體,稱Fab2,能和兩個相同的抗原結(jié)合;另一片段類似Fc,隨后被分解 成小分子多肽,無生物活性。 IgM是由五個單體組成的五聚體,含 10個重鏈和10個輕鏈,具有10個抗原結(jié)合價,由于空間位置的影響,只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價。IgM分子量約為900000, IgG分子量約為150000。 機體被微生物感染后,先產(chǎn)生 IgM抗體,然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間,IgM抗體量逐漸減少而消失,而IgG抗體可長期存在,在疾病*后可持續(xù)數(shù)年 之久。 IgM抗體一般為保護性抗體具有免疫性。因此IgM抗體的測定,對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值。右圖為為甲型肝炎 病人血清中IgG抗體和IgM抗體出現(xiàn)的時間和水平。 

抗原抗體反應(yīng) 

可逆性 

抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡,其反應(yīng)式為: Ag+AbAg·Ab 抗體的親和力(affinity)是抗原抗體間的固有結(jié)合力,可以用平衡常數(shù)K表示: K=[Ag·Ab][Ag][Ab] Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合,兩者結(jié)合牢固,不易解離。解離 后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性,因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中,特異性的IgG抗體僅占總IgG中 的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體,稱為親和層析純抗體,應(yīng)用于免疫測定中可得到更好的效果。 

zui適比例 

在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物(沉淀)的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例zui合適的范圍,稱為等價帶(zone of equivalence)。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩,則無沉淀物形成,在免疫測定中 稱為帶現(xiàn)象(zone phenomenon)??贵w過量稱為前帶(prezone),抗原地過量稱為后帶(postzone)。在用免疫學(xué)方法測定抗 原時,應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量,否則測得的量會小于實際含量,甚至出現(xiàn)假陰性。 特異性 

抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系,所以抗原 抗體反應(yīng)具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原( HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg),隨來源于同一病毒,但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合,而不與另外兩種抗體 反應(yīng)??乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物(例如血清)中測定某一特定的物質(zhì),而不需先分離待檢物 。 但是這種特異性也不是的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu),在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如:絨毛膜促性腺激素( hCG)和黃體生成激素(LH)均由α和β兩個亞單位組成,其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位,而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫 動物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體,抗α-hCG抗體將與LH中的 α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗中,如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG,只能用于hCG濃度較高的試驗,否則 婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷(敏感度應(yīng)達到50mIu/mlhCG)的實際中必須 應(yīng)用只對hCG特異的抗β-hCG,以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。 

敏感性 

在測定血清中某一物質(zhì)的含量時,化學(xué)比色法的敏感度為 mg/ml水平,酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml,免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免 疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍,達ng/ml水平。例如,用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg,其敏感度可達0.1ng /ml。 

免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用 

由于各種抗原成份,包括小分子的半抗原,均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體,利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原 ,因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣,在臨床檢驗中可用于測定: 1) 體液中的各種蛋白質(zhì),包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。 2) 激素,包括小分子量的甾體激素等。 3) 抗生素和藥物。 4) 病原體抗原,HBsAg、HBeAg等。 5) 另外,也可利用純化的抗原檢測標(biāo)本中的抗體,例如抗-HBs等。 

標(biāo)記的免疫測定 

如上所述,免疫測定是一種很敏感的測定方法,抗原抗體反應(yīng)后直接測定形成的沉淀或濁度,敏感度可達 5~10μg/ml,但在臨床檢驗中,某些待測物在標(biāo)本中的含量遠低于這一水平,因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測定是 將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標(biāo)記,通過測定標(biāo)記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中,標(biāo)記物分別 為放射性核素和酶,zui后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量,敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測定中, 一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測物*反應(yīng)。以標(biāo)記抗體(Ab ※)檢測抗原(Ag)為例,反應(yīng)式如下: Ag+ Ab※ → AgAb>+ Ab※ 

在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab※和游離和Ab※ ,如不將兩者分離而測定標(biāo)記物,測得的結(jié)果將為兩者之和。因此,游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測定中的重要步驟。可采 用多種手段,固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上,然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng),結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載 體上,而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab ※除去,結(jié)合標(biāo)記物的測定可在固相上進行。 

酶免疫測定 

酶免疫測定(enzyme immunoassay)可分為均相(homogenous)和非均相(heterogenous)兩種類型。在均相EIA中可 不需進行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測定標(biāo)記物。例如在某種條件下,抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去 其對底物作用的活力,因而測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應(yīng)用。非均相EIA需先進行游離的和 結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述,固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年zui初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑 測定(enzyme linked immunosorbent assay),簡稱ELISA,在國內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗的,雖然含義不*確切,但已習(xí)用 

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