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細(xì)菌RNA提取試劑盒說明書
更新時(shí)間:2021-11-24 點(diǎn)擊量:1962

 

細(xì)菌RNA提取試劑盒說明書

RNApure Bacteria Kit

細(xì)菌RNA提取試劑盒

 

Cat. No.   K0536

保存:室溫

 

組分說明

 

                                              Cat. No.              K0536

                                              Kit Size                 50

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2concentrate)          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Shredder Spin column             50

                                         Spin Column RM                50

                                    Collection Tube1.5 ml)            50

                                     Collection Tube2 ml)            100

 

產(chǎn)品簡介

 

     本試劑盒采用高效、專一結(jié)合核酸的離心吸附柱和*的緩沖系統(tǒng),可從細(xì)菌或培養(yǎng)的動物細(xì)胞中快速提取總 RNA30-40 分鐘內(nèi)即可完成反應(yīng)。提取的總RNA 純度高,沒有蛋白質(zhì)和其他污染,如果是對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實(shí)驗(yàn),殘留的DNA 可利用無 RNase DNase I 在柱上進(jìn)行消化去除。提取的RNA 適用于RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

 

注意事項(xiàng)

 

1.預(yù)防RNase污染,應(yīng)注意以下幾方面:

1)使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。

2)玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí),塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。

3)配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

4)操作人員戴一次性口罩和手套,實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。

2. 提取的樣品避免反復(fù)凍融,否則影響RNA提取的量和質(zhì)量。

 

3. 使用前請檢查 Buffer RL 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀,可置于 56℃水浴重新溶解。Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇,

    至終濃度為 1%。如 1 ml Buffer RL 10 μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個(gè)月。

 

4. 第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5. 所有離心步驟若無特殊說明均在室溫下進(jìn)行,且所有操作步驟動作要迅速。

 

6. 若下游實(shí)驗(yàn)對 DNA 非常敏感,建議用不含 RNase DNase I(貨號:K2090A)對 RNA 進(jìn)行處理。

 

自備試劑:LysozymeK0887)、TE緩沖液、β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA專用)  

 

 

操作步驟

 

 1. 4℃  10,000 rpm~13,400×g)離心2分鐘收集菌體(菌體量最大不超過1×109 ),小心去除所有上清。

     注意:上清如果有殘留,會影響后續(xù)的消化過程。

 

 2. 用含有Lysozyme100  μl TE緩沖液*重懸菌體,室溫孵育。具體配方和孵育時(shí)間如下:

 

TE 緩沖液中 Lysozyme 的終濃度            孵育時(shí)間

 

G 細(xì)菌                  400  μg/ml              3-5 分鐘

                          -

G+ 細(xì)菌                3 mg/ml                   5-10 分鐘

 

3. 加入350  μl Buffer RL(使用前請檢查是否加入β-巰基乙醇),渦旋震蕩混勻(此步驟可能出現(xiàn)不溶性沉淀)。將溶液與沉淀全部加入到已裝入收集管(Collection Tube 2 ml)的過濾柱(Shredder Spin Column)中,10,000 rpm離心2分鐘,收集濾液,棄掉過濾柱。

 4. 向上步得到的濾液中加入250  μl無水乙醇,混勻(此時(shí)可能會出現(xiàn)沉淀)。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入到已裝入收集管(Collection Tube 2 ml)的吸附柱(Spin Column RM)中,10,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

 5. 向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1,10,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

可選步驟:如果要進(jìn)行對微量DNA非常敏感的RNA實(shí)驗(yàn),則用以下步驟替代步驟5。

     1)向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1,10,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

 

     2)配制DNase I  混合液:取52 μl RNase-Free Water,向其中加入8  μl 10 × Reaction Buffer  20 μl DNase I1 U/μl),混勻,  配制成終體積為80  μl的反應(yīng)液。

 

       注意:  以上體系為按照我公司產(chǎn)品DNase I YJ2090A)反應(yīng)體系進(jìn)行配置,應(yīng)用其他公司產(chǎn)品請參考相應(yīng)說明書。

    3)向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液,20-30℃孵育15分鐘。

    4)向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

 6. 向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇), 10,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

 7. 重復(fù)步驟6

 8. 12,000 rpm 離心 2 分鐘,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘,以*晾干。

     注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除,乙醇?xì)埩魰绊懞罄m(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR)。

 9. 將吸附柱置于一個(gè)新的無RNase的離心管(Collection Tube 1.5 ml)中,向吸附柱的中間部位加入30-50  μl

      RNase-Free Water,室溫放置1分鐘,10,000 rpm離心1分鐘,收集RNA溶液,-70℃保存RNA,防止降解。

注意:1)  RNase-Free Water 體積不應(yīng)小于 30 μl,體積過小影響回收率。

 

2)如果要提高RNA的產(chǎn)量,可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復(fù)步驟9。

 

3)如果要提高RNA濃度,可將得到的溶液重新加入到吸附柱中,重復(fù)步驟9。

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):


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