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如何正確使用凋亡檢測試劑盒?
更新時間:2022-10-19 點擊量:896
  細胞凋亡是細胞的基本特征之一,在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一種分子量為35.8 KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與細胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)高親和力特異結(jié)合。FITC-Annexin V結(jié)合到凋亡細胞后,在藍色光的激發(fā)下,發(fā)出綠色熒光,區(qū)分出凋亡細胞與正常細胞。碘化丙啶(Propidium iodide,PI)是一種核酸染料,它不能穿透完整細胞膜,但對凋亡晚期細胞和死細胞的破損細胞膜能夠穿透,并使細胞核紅染。將FITC-Annexin V與PI匹配使用,可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞區(qū)分開來。
 
  凋亡檢測試劑盒的操作方法:
 
  1.組織經(jīng)福爾馬林固定后會產(chǎn)生廣泛的蛋白質(zhì)交連,因此石蠟組織進行凋亡檢測時要進行預(yù)處理。經(jīng)我公司科研人員的長期研究認為:TUNEL染色時蛋白酶K的作用有可能引起內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的釋放,造成假陽性反應(yīng),同時過量的蛋白酶K處理可破壞組織的結(jié)構(gòu),用微波技術(shù)替代上述處理可避免上述弊端的出現(xiàn)。
 
  2.微波已被愈來愈多地作為免疫組織化學(xué)和原位雜交的預(yù)處理過程,經(jīng)一定溫度的微波處理可修復(fù)因固定和包埋造成的抗原破壞,打斷氨基酸的肽鍵結(jié)合,促進抗原決定簇的暴露,恢復(fù)細胞膜的空間結(jié)構(gòu),增加穿透效應(yīng),加速組織處理及染色過程。我們在作TUNEL染色前進行微波修復(fù),可以達到蛋白酶K的功效,取得較為理想的效果,背景染色很淺,凋亡細胞陽性顆粒與背景染色對比非常鮮明。
 
  3.蛋白酶K作用的條件嚴格,消化度常因組織的不同而在操作中不便掌握。同時蛋白酶K的價格昂貴,而微波已作為一種常用儀器用于免疫組織化學(xué)染色中。
 
  (1)切片常規(guī)脫蠟入水
 
  (2)將一燒杯盛200ml的0.01M、pH6.0的檸檬酸緩沖液,加熱至90~95℃,迅速放入切片,使用680W(80%功率)、微波照射1min,加入雙蒸水(20~25℃)80ml作迅速冷卻,將玻片移至PBS(20~25℃)。(3)PBS洗5min×3次。
 
  (4)加20%正常牛血清室溫30min。
 
  (5)將TUNEL反應(yīng)混合液加在切片上,37℃溫育90min(陰性對照片、TUNEL混合液中不加TDT)。
 
  (6)PBS洗5min×3次。
 
  (7)3%H2O2甲醇液室溫阻斷10min。
 
  (8)37℃溫育90min。
 
  (9)加POD轉(zhuǎn)化劑,37℃溫育30min。
 
  (10)PBS洗5min×3次。
 
  (11)DAB/H2O2顯色。
 
  (12)蘇木素淡染,常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封固。
 
  結(jié)果:細胞核呈棕色顆粒者為陽性細胞,結(jié)合形態(tài)特征,可確立凋亡細胞。陰性對照片無棕色顆粒。

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