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豬弓形蟲抗體檢測的試驗(yàn)原理及操作步驟
更新時(shí)間:2019-10-24 點(diǎn)擊量:3301
      一、豬弓形蟲抗體檢測的實(shí)驗(yàn)原理:
  本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定標(biāo)本中豬弓形蟲抗體(Tox-Ab)。用純化的弓形蟲抗體(Tox-Ab)抗原包被微孔板,制成固相抗原,可與樣品中弓形蟲抗體(Tox-Ab)相結(jié)合,經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的弓形蟲抗體(Tox-Ab)抗原結(jié)合,形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),與CUTOFF值相比較,從而判定標(biāo)本中弓形蟲抗體(Tox-Ab)的存在與否。
  二、豬弓形蟲抗體檢測的試驗(yàn)操作步驟:
  1.編號(hào):將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)
  2.加樣:分別在陰、陽性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽性對(duì)照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,
  3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
  4.配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
  5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
  6.加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。
  7.溫育:操作同3。
  8.洗滌:操作同5。
  9.顯色:每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘
  10.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
  11.測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

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