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端粒酶活性檢測實驗

端粒酶活性檢測實驗

產(chǎn)品型號:

所屬分類:酶活性檢測實驗

產(chǎn)品時間:2024-08-30

簡要描述:收費標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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詳細(xì)說明:

端粒酶活性檢測實驗

  

端粒酶(Telomerase)是由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA組分(hTR)于1995年被克隆,其中含有端粒重復(fù)序列的模板(5'-CUAACCCUAAC-3');蛋白質(zhì)組分具有RNA依賴的DNA多聚酶活性,結(jié)構(gòu)尚不清楚。端粒酶能以自身RNA的模板區(qū)為模板復(fù)制合成端粒序列。在胚性細(xì)胞等增殖活躍的細(xì)胞中具有端粒酶活性,而在正常成熟體細(xì)胞中端粒酶失活,同時還發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都呈端粒酶陽性,而在癌旁組織和正常組織陽性率很低,推測端粒酶可能是一個廣 泛的腫瘤標(biāo)志物。因此近幾年端粒酶在各種腫瘤中的研究日益深入,同時促進了檢測方法的改進與完善。本文對其檢測方法綜述如下。

1基本原理

  端粒酶在體外可以以其自身RNA的模板區(qū)為模板,在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個堿基的重復(fù)序列,用聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳可顯示6個堿基差異的梯帶。1994年Kim建立 了基于PCR基礎(chǔ)上的端粒重復(fù)序列擴增法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)。TRAP反應(yīng)原理見下圖。

 

首先合成一個18nt的TS做 上游引物,端粒酶結(jié)合TS末端的GTT并合成ggtag,然后每經(jīng)過一-次轉(zhuǎn)位合成一個gttag的6堿基重復(fù)序列,端粒酶滅活后,加入-個24nt的CX做下游引物,經(jīng)過多次變性退火延伸,擴增端粒酶延伸產(chǎn)物。

2基本技術(shù)方法

2.1標(biāo)本來源術(shù)摘除組織,針吸活檢組織,胸水,腹水,膀胱或胰管沖洗液,棉拭子所取分泌物和尿液(尚有爭議)等。

 

2.2端粒酶的提取方法早期采用超聲等物理破碎的方法在不同細(xì)胞中的提取效率差異較大,此后采用去污劑(如CHAPS)裂解的方法在少量細(xì)胞獲取了較穩(wěn)定的端粒酶提取液?,F(xiàn)詳述如下: 40 ~ 100mg冷凍(-70%°C)組織或104 ~ 106沉淀細(xì)胞用冰預(yù)冷的洗液[10mM hepes-KOH(pH7 .5), 1.5mM MgCI2, 10mM KCI,1Mm DTT]洗1次,10000g4°C離心1min, 沉淀加200μ冷裂解液[10mM tris-HCl(Ph7 .5), 1mMMgC12,1mM EGTA, 0.1mM PMSF, 5mM β-巰基乙醇,0.5%CHAPS, 10%甘油,自動勻漿器冰浴中勻漿,450rpm,25min, 16000g49C離心20min,移取上清160μI,部分樣品用于蛋白定量,其余迅速冷凍,-70°C保存。端粒酶經(jīng)小于10次凍融可保持活性穩(wěn)定。部分學(xué)者對某些標(biāo)本用05%Tween-20代替0.5%CHAPS獲得更好的效果。

 

2.3 TRAP擴增50μITRAP體系包含20mM tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgCI, 63mM, KCI, 0.005%Tween-20,1mM EGTA, 50μMdNTP, 0.1ug tS, 1μg T4基因32蛋白,0. 1mg/ml牛血清白蛋白,1 ~ 2μICHAPS細(xì)胞提取液(含6μg)蛋白,0.2 ~ 0.4u[a-32P]dGIP或[a-32P]dGIP(10μCiμl, 3000Ci/mmol),這一-反應(yīng)體系可同時滿足端粒酶Tap聚合酶的活性需要,239C10min合成端粒酶延伸產(chǎn)物后,949C3s滅活端粒酶,加入0.1μg cX和2U Taq酶,94°C30s, 50°C30s, 72°C1 .5min擴增27個循環(huán),25μ爐 物進行15%PAGE凝膠電泳。

 

2.4引物設(shè)計為了防止上、下游引物之間的結(jié)合,在CX引物上設(shè)計了3個不匹配堿基(見圖1處),單鏈結(jié)合蛋白T4基因32蛋白可進一步避免引物之 間的結(jié)合,TS和CX引物被廣為采用,在上述條件下,只有延伸了三至更多的GGTTAG片斷才有特異擴增,即得到從40bp開始的6bp差異的梯帶。Broccol等以5'-GGCGCG(ACCCTA)3-3'代替CX引物,由于增加了G-C含量,可提高退火溫度,進一步避免引物間的結(jié)臺,增加特異性。Oncor公司設(shè)計RP引物代替CX引物,得到從50bp開始的6bp差 異的梯帶。

 

3擴增片斷的檢測

 

3.1同位素法Kim建立的方法即為同位素法,其應(yīng)用多。采用[a-32P]dGTP或dCTP摻入的報道很多,但部分學(xué)者用[y-32P]dATP和T 4激酶標(biāo)記TS引物的5端,發(fā)現(xiàn)更易于檢出低水平的端粒酶,同時更易定量。PAGE凝膠電泳后在X-光片上放射自顯影或用Phosphoimager儀掃描測定3h。同位素法的優(yōu)點是靈敏度高,100個永生化細(xì)胞27個循環(huán)即可檢出,缺點是存在放射性污染,且放射自顯影需8h至兩天以上時間,時間較長。

 

3.2染色法電泳后用SYBR green或EB染色,然后紫外燈下觀察或用CCD圖像系統(tǒng)測定。EB在302nm紫外透射儀和桔紅色紫外濾光片下效果hao,可得與SYBR green相近的敏感性。染色法簡便,快速,靈敏度為100個永生化細(xì)胞30個循環(huán),由于染色帶的信號強度不能精*&確反映其分子數(shù)(大片斷染色更強),因此染色法只能判定相對端粒酶活性,而不能測定端粒酶延伸產(chǎn)物的確切數(shù)量。

 

3.3熒光法加入10pmo熒光素標(biāo)記(如FAM,F(xiàn)ITC)的TS和/或CX引物擴 增,經(jīng)8%的變性PAGE凝膠電泳,DNA測序儀自動讀取數(shù)值,片斷管理系統(tǒng)軟件自動計算掃描曲線的峰高和峰面積,從上樣到出結(jié)果僅需90min。熒光系統(tǒng)極敏感,為避免過量擴增產(chǎn)物可能給出不可靠結(jié)果,要使用0.5~ 1.0μg的低蛋白量,擴增27個循環(huán),由于片斷管理系統(tǒng)能自動檢出很微弱的熒光,因此不能精*&確測定低水平端粒酶活性[8 ~11]。熒光法的另一-應(yīng)用是于原位一-TRAP分析, 可以在細(xì)胞水平.上檢出端粒酶活性,因此可以判定是哪些細(xì)胞、多少細(xì)胞具有端粒酶活性,而裂解提取法不能知其活性的細(xì)胞來源。原位分析在硅化玻片上進行,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。目前只用于新鮮標(biāo)本,用凍存病理標(biāo)本的實驗尚不成功,需改進方法防止凍融中

胞內(nèi)端粒酶的分散及增加標(biāo)本的滲透性等。

 

3.4 ELISA法TS弓|物5'端標(biāo)以生物素,PCR擴增后,將產(chǎn)物變性,加入異羥基洋地黃毒苷標(biāo)記的可與擴增產(chǎn)物的重復(fù)片斷特異結(jié)合的探針,雜交產(chǎn)物上的生物素與固定在微孔板上的卵白素相結(jié)合,而探針上的異羥基洋地黃毒苷與過氧化物酶標(biāo)記的抗異羥基洋地黃毒苷抗體結(jié)合,然后加入底物,顯色后用酶標(biāo)儀測定。

ELISA法是寶靈曼試劑盒使用的方法,由于沒有電泳,因此觀察不到6bp差異的梯帶。

 

4質(zhì)量控制

 

4.1排除假陽性設(shè)置以下四種對照(1)85°C10min滅活端粒酶; (2)端粒酶對RN ase敏感,0. 5μg/10μ提取液+1ugRNase, 37°C, 20min; (3)不加提取液; (4)不加CX或TS引物。以上實驗可排除引物二聚體或PCR污染。

 

4.2排除假陰性

 

(1)以陽性細(xì)胞沉淀(106細(xì)胞)的裂解提取液為陽性對照進行TRAP分析可以排除由于試劑質(zhì)量不好造成的假陰性。

 

(2)組織提取液中Taq酶抑制物的存在會造成假陰性,為此Wright等加入一個150bp的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的獲得方法如下:設(shè)計TS加長引物: 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC-3和CX加長引物: 5'-(CCCTTA)3CCCTAATAGGCGCTCAATGTA-3',分別在TS和CX引物的3端增加15個堿基,可與編碼鼠肌蛋白的97 ~ 132位氨基酸的堿基匹配,擴增后得到150bp產(chǎn)物,柱純化后備用。每個TRAP反 應(yīng)加入15ag內(nèi)標(biāo)為模板,TS和CX引|物既可擴增端粒酶延伸產(chǎn)物,又可擴增150bp的內(nèi)標(biāo),當(dāng)無150bp擴增帶出現(xiàn)時說明存在Taq酶抑制劑,這對內(nèi)標(biāo)為眾多學(xué)者所采用。也有其它學(xué)者采用200bp或36bp的內(nèi)標(biāo)[4.8,14]。

 

(3)稀釋提取液可降低酶抑制物濃度,擴增帶從無到有說明含酶抑制物。為了減少甚至排除某些標(biāo)本中存在的抑制物的影響,許多學(xué)者在得到端粒酶延伸產(chǎn)物后進行酚一氯訪異戊醇(25.24:1)抽提,酒精沉淀純化。

 

5端粒酶活性的半定量檢測

由于端粒酶活性在少數(shù)正常組織細(xì)胞中有微弱的表達(dá),而且與細(xì)胞的增殖活躍程度、腫瘤的惡變程度及預(yù)后等有關(guān),因此半定量測定端粒酶活性在臨床應(yīng)用上意義重大。簡便的方法是通過10倍稀釋提取液以有無6bp差異的梯帶產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)。在任何稀釋度下無產(chǎn)物為(-);不稀釋下有產(chǎn)物為(+); 10倍稀釋下有產(chǎn)物為(++); 100倍稀釋 下有產(chǎn)物為(+++),還可再進行1000倍稀釋。 Wright等將內(nèi)標(biāo)引入后使端粒酶活性的半定量檢測成為可能,將6bp差異的梯帶強度總和和除以內(nèi)標(biāo)的強度進行標(biāo)準(zhǔn)化后,在10 ~ 11000個細(xì)胞間具有很好的線性關(guān)系,而無內(nèi)標(biāo)時在大于300個細(xì)胞即進)平臺。許多學(xué)者采用這種方法描述相對端粒酶活性。Oncor試劑盒(1996年第 2版)提供了更為準(zhǔn)確的方法,用Phosphoimager儀掃描測定凝膠信號,

TPG(Total product Generated,總生成產(chǎn)物)單位((x-0)/)((-0)/C)x100(TSR8為0.1amol), 其中x代表無熱滅活處理標(biāo)本管中梯帶信號總和; x0代表熱滅活管信號; r代表T SR8質(zhì)控管梯帶信號總和,TSR8是人工合成的寡核苷酸鏈,由于TS連接AG(GGTTAG)7構(gòu)成; r0代表無標(biāo)本的裂解液對照管信號; c和cR分別代表無熱滅活處理標(biāo)本管和TSR8質(zhì)控管中內(nèi)對照的信號,每個TPG單位相當(dāng)于1x10- 3amol或600個TS引物分子30°C,10min延伸至少4個端粒重復(fù)序列的數(shù)量,在1 ~ 300TPG(相當(dāng)于約30 ~ 10000個陽性對照細(xì)胞中所含端粒酶活性)范圍內(nèi)成線性。

 

6總結(jié)

綜上所述,Kim建立的同位素法靈敏度高應(yīng)用多,但是存在放射性污染且時間較長,染色法操作簡便時間短,不過只能檢測相對端粒酶活性,熒光法只用于新鮮樣本,在日常的應(yīng)用中大家可根據(jù)具體情況選擇不同方法或?qū)ζ溥M行簡單的組合操作。

 

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